Selecția naturală în natură și în laborator Efectul selecției este studiat nu numai în experimente de laborator, ci și în timpul observațiilor pe termen lung în natură. Prima abordare vă permite să controlați condițiile de mediu, izolându-vă de nenumăratele vieți reale

Capitolul 10 Lumea virușilor și evoluția ei Trans. Virușii G. Janus au fost descoperiți ca ceva complet neremarcabil, și anume o varietate neobișnuită de agenți infecțioși și, posibil, un tip special de toxină care provoacă boli ale plantelor, de exemplu, mozaicul de tutun. Din moment ce aceşti agenţi

Descoperirea virușilor filtrabili Viruși... Ființe vii care puteau fi văzute doar cu un microscop electronic cu o mărire de zeci de mii de ori și o structură fină de o sută de mii de ori sau mai mult. Virologia este știința virușilor, a căror înflorire a devenit posibilă abia în secolul nostru

3.1. Materialul genetic al virusurilor și procariotelor Materialul genetic al virusurilor este reprezentat de o moleculă de acid nucleic (fie ADN, fie ARN) înconjurată de o înveliș proteic protector - capside. Virușii funcționează diferit în funcție de acestea

46. ​​Culturi celulare și tipurile lor. Un sistem în care celulele, țesuturile sau organele îndepărtate din organism își păstrează viabilitatea timp de cel puțin 24 de ore. Supraviețuire: în care celulele își păstrează doar activitatea inerentă de viață fără a se reproduce. În creștere: își păstrează activitatea inerentă de viață și sunt capabile de proliferare. După natura creșterii, acestea sunt împărțite în 3 grupe: suspensie; plasmă (culturi de bucăți fixe de țesut); un singur strat. Cele cu un singur strat sunt împărțite în 4 grupe: primar tripsinizate; subculturi; semi-saltabilă și intercalabilă. Suspensie: cresc sub formă de suspensii, celulele se înmulțesc cu un mediu special plus amestecare constantă folosind role. Celulele cresc pe toată suprafața saltelei. Un număr mare de celule pentru vaccinuri. plasma: bucăți de țesut fixate prin plasmă, aceasta este cultura de țesut. Se obține prin fixarea unei bucăți de țesut pe o sticlă virusologică, apoi adăugarea de mediu de groapă și cultivarea acestuia; în acest caz, creșterea celulară este înregistrată de-a lungul periferiei unei bucăți de țesut. Folosit pentru a obține bucăți de țesătură. Un singur strat: Pentru a indica un virus. Se obține din țesuturi sau organe prin tratarea acestora cu tripsină. Subculturile se obțin din cele primare prin altoire. Apoi, semitransplantat prin transplanturi multiple. Au un set diploid de cromozomi. Poate supraviețui diploid în funcție de vârstă sau țesut din care a fost obținută cultura celulară. Dacă embrionul este de până la 80 de zile. Pentru un adult - nu mai mult de 25 de transplanturi. Nu există mai mult de 5 cele vechi. Cele transplantate sunt celule mutante care sunt canceroase. Ele durează de un număr infinit de ori. Acestea sunt celule transformate ale unei tumori canceroase. Hela este cea mai faimoasă cultură celulară continuă din 1956. Această cultură este prezentă în toate laboratoarele din lume. Este adaptat la mulți agenți patogeni. Primii-născuți au o serie de avantaje: nu mor; rata de crestere mai mare; toate sunt omogene genetic. În laboptoria se mențin prin reînsămânțare dintr-un vas în altul.

59. CPD. Aceasta este o metodă de indicare a virusului în cultura celulară. CPD se referă la orice modificare a celulelor dintr-o cultură celulară sub influența unui virus care se reproduce în ele. Folosesc o mărire scăzută când mă uit la stratul superior al saltelei. Comparați celulele infectate cu cele neinfectate. Diferențele se pot extinde pe întregul monostrat sau numai în pete. Ele sunt evaluate în kristas sau puncte. Deci, dacă întregul monopol al CPU a suferit o modificare, acesta este estimat la 4 cruci; dacă ¾ - cu 3 cr; ½ cu 2 cr; ¼ - pentru 1 cruce. Formele CPD depind de proprietățile biologice ale virusului, tipul de celule, doza de infecție, condițiile de cultivare etc. Unii virusuri prezintă CPD după 2-3 zile, alții după 1-2. 3 forme de CPU: fragmentare– distrugerea celulelor în fragmente separate, care sunt separate de sticlă și trec în fluidul de cultură. Rotunjire– celulele își pierd capacitatea de a se atașa de sticlă, iau formă sferică, se separă și plutesc liber acolo unde mor. Formarea simptomatologiei– dizolvarea membranelor celulare, în urma căreia citoplasmele celulelor învecinate se contopesc, formând un singur întreg în care se află nucleii celulari. Astfel de formațiuni se numesc simplaste - celule polifage gigantice. Este necesar să se efectueze cel puțin 3 treceri oarbe pentru a aprecia prezența virusului în materialul de testat. Hemadsopțiunea este legătura dintre celulele roșii din sânge cu suprafața celulelor infectate cu virus.

51. Calculul titrului virusului după Reed și Mench. Titrarea virusului cu efect evaluat statistic cu calculul titrului prin citire și meniu. Pentru această metodă de titrare se poate folosi orice model biologic, dar acest model trebuie să fie sensibil la virusul care urmează să fie titrat (culturi celulare, embrioni, animale de laborator). În funcție de efectul infecțios al modelelor biologice infectate, acestea sunt împărțite în următoarele: recunoscute clinic; în funcție de modificările patomorfologice; la moartea modelului; prin acumularea de hemaglutinină. Rezultatele muncii depind de doza de virus. S-a stabilit că doza de virus care provoacă 50 la sută din efectul infecțios este cea mai puțin susceptibilă la fluctuații și este cea mai determinabilă dintre toate dozele posibile. Titrul este exprimat în doze eficiente de 50%. Acesta este un DE de 50. În funcție de modelul biologic utilizat și de efectul obținut, doza de 50 la sută poate fi exprimată în următoarele unități: LD 50 – ID 50 ELD 50 EID 50 TsPD 50– aceasta este o doză citopatogenă de 50 la sută determinată în culturi celulare prin CPD. Dacă în sistemele infectate nu observăm 50 la sută din efectul că ID 50, atunci titrul se calculează prin citire și meniu: lg LD 50 = lg ECD - (% ani de ECD - 50%) / (% ani de ECD - % ani de ECD) TOATE ACESTEA MULTIPLITE CU multiplicitatea lg ori

36. Reguli și orele de funcționare într-un laborator de virologie. Toți elevii sunt instruiți și instruiți în siguranța tr. Este interzisă intrarea în spațiile de producție a persoanelor neautorizate, precum și intrarea fără halat și încălțăminte de schimb. Este interzisă ieșirea în afara laboratorului purtând halat și șapcă. Fumatul, mâncatul în laborator și păstrarea alimentelor. Toate materialele care intră în laborator trebuie considerate infectate. La sfârșitul lucrării, locul de muncă este pus în ordine și de-identificat complet. Etichetarea ustensilelor care conțin material infecțios. Mâinile care poartă mănuși sunt spălate într-un borcan cu o soluție de cloramidă 5%, apoi mănușile se scot și se dezinfectează pentru a doua oară, se dezinfectează și se spală. ra Activitatea virologului laboratorului este construită pe trei principii principale: preveni infectarea angajaților sau a persoanelor care lucrează cu materiale care conțin viruși. Preveniți contaminarea materialului (uneltele, ustensilele sunt sterile) curățarea localului cu o soluție dezinfectantă + lămpi cu ultraviolete. Preveniți transportul virusului în afara laboratorului (cu aer, ustensile, material solid și lichid). Pipetele și paharele trebuie aruncate în sterilizator. Eprubete cu viruși, țesuturi - într-o autoclavă. Nu deschideți centrifuga până nu se oprește. Trebuie doar să eliminați aerul din seringă folosind un tampon de bumbac cu 75% alcool. Este interzisă ventilarea încăperii folosind un sistem de ventilație cu filtru.

37. Măsuri de siguranță în cazul materialelor care conțin virusuri. Preveniți dispersarea virușilor în mediul extern. Preveniți contaminarea (contaminarea) materialului care conține virusuri cu microfloră străină. Asigurați siguranța personală. Pentru a respecta aceste cerințe, sunt necesare următoarele reguli de lucru: ​​fii atent și îngrijit; fii doar în halat și schimbă-te în garderobă; se lucrează numai cu manșete cu nasturi, o șapcă și o mască de tifon; menține cu strictețe curățenia și ordinea în laborator; nu ar trebui să existe obiecte străine pe desktop; Fumatul și mâncatul sunt interzise. Folosiți instrumente și ustensile sterile. Lucrați cu vase lângă flacăra arzătorului. Nu vă puneți degetele în gură. Dispozitive folosite în sterilizator. Colectați pipetele folosite într-un vas cu o soluție dezinfectantă. Colectați deșeurile solide sau lichide (vată) în recipiente speciale pentru dezinfecția ulterioară. Nu turnați deșeurile în chiuvete sau toalete.

33. Mecanismul acţiunii antivirale a interferonului. Interferonul nu are un efect direct asupra virusului. Afectează doar celula prin activarea sintezei anumitor enzime celulare. În special, enzima protein kinaza și 2,5 oligoasintetaza. Informațiile despre sinteza acestor enzime se află, de asemenea, în anumite regiuni ale genelor celulei și sunt, de asemenea, într-o stare represivă. Sub interfecțiunea aerului există dereprimarea genelor responsabile de sinteza protein kinazei și 2,5 iligoAs sintetazei. Și sinteza lor crește brusc. 1) sub aerul proteinei kinazei, factorul de inițiere este fosforat, ceea ce asigură legarea ARN-ului mesager viral de ribozom. Astfel, ARN-ul mesager viral nu poate contacta aparatul ribozomal al celulei, adică începutul translației. Și în cele din urmă, sinteza proteinelor și enzimelor virale devine imposibilă. 2) sub influența interferonului se activează sinteza 2,5 oligoAsintetazei, care catalizează sinteza acidului 2,5 oligoadenilic în celulă. Acest acid schimbă acțiunea nucleazelor celulare pentru a distruge ARN-ul mesager viral. Astfel, sub influența interferonului, apar următoarele: blocarea translației ARN-ului mesager viral; distrugerea ARN-ului mesager viral. Efectul inhibitor al interferonului asupra reproducerii celulare: interferonul în concentrații de la 0 la 1000 de unități per ml suprimă reproducerea unei game largi de celule în orice țesut. Interferonul reglează creșterea multor tipuri de celule, inclusiv culturile de celule primare și celulele tumorale. Se bazează pe suprimarea sintezei anumitor proteine ​​celulare și sinteza de noi proteine ​​de către interferon. Inter crește activitatea ucigașă a limfocitelor T. În doze mari, acestea inhibă formarea anticorpilor. Dozele mici, dimpotrivă, stimulează formarea de anticorpi. Krilling – celulele tratate cu doze mici de interf produc mai mult interfer decât celulele netratate. Doze prea mari - procesul opus.

35. Tipuri de interacțiune între virus și celulă. Productiv și abortiv. Productiv este împărțit în litic și latent. Productiv: Acesta este un tip de interacțiune în care se formează o nouă generație de virion în celulă. Dacă celula moare rapid după dobândirea unui nou virion, atunci aceasta este o cale litică productivă de interacțiune între virus și celulă. Dacă celula în care virusul crește mult timp își păstrează viabilitatea (prin înmugurire), atunci acesta este un produs al unui tip latent de interacțiune. Avortiv: Acest tip este reciproc atunci când reproducerea virionilor se oprește în orice stadiu, virionul nu se dezvoltă. Ca urmare a interacțiunii virusului cu celula, în celulă pot apărea următoarele modificări: degenerarea celulară– celulele se transformă mai întâi într-o formă neregulată, apoi se rotunjesc, apare granularitatea în citoplasmă, apoi fragmentarea nucleară apoi moartea celulară. Astfel de modificări se numesc CPD. În încrucișări: 4 încrucișări – eficiență 100%. Formarea simplastelor– celule multinucleate. Formarea corpurilor de incluziune– conţinând mb, ARN sau ADN intranuclear şi plasmatic. Transformarea celulelor– virusuri oncogene (retrovirusuri ARN). Reproducerea virusurilor oncogene într-o celulă nu este însoțită de CPD. Celula produce în mod constant un virus. Sinteza interferonului.

4. Rezistența virusurilor la factorii fizico-chimici. Rezistența virusurilor animale a fost relativ bine studiată atunci când sunt expuși la factori externi: temperatură, radiații, ultraviolete, ultrasunete, pH, formaldehidă, fenol etc. Pentru a proteja împotriva acestor influențe, virionii au o înveliș proteic. Structura și compoziția chimică diferite a învelișurilor proteice determină stabilitatea diferită a virusurilor. În funcție de aceste caracteristici, același factor poate distruge unii virioni complet și nu pe alții. De exemplu, solvenții organici: acei virioni în învelișul cărora nu există lipide sunt rezistenți la aceste substanțe, iar cei care conțin lipide sunt distruși rapid. Inactivarea virusurilor înseamnă pierderea completă sau parțială a activității lor biologice, care are loc ca urmare a acțiunilor factorilor fizici și chimici. Când acidul nucleic viral și proteina se schimbă, are loc inactivarea completă, adică pierderea tuturor proprietăților biologice ale virusului - își pierde numai proprietățile infecțioase și își păstrează imunogenitatea. Natura si amploarea agentilor de natura chimica si fizica care actioneaza asupra virusului depind de natura factorului de inactivare, de doza, timp indelungat, de tipul de virus. Când virusul este inactivat, poate avea loc fie scindarea proteinelor învelișului, urmată de dezintegrarea acestuia în unități separate, fie compactarea proteinelor menținând în același timp structura generală a învelișului. Clivajul se observă sub acțiunea unui mediu acid și alcalin cu încălzire prelungită și scăzută. Coagularea și compactarea apar atunci când sunt expuse la formaldehidă, la temperatură ridicată sau la fenol. Depinde de concentrare și durată. Astfel, în unele cazuri, coagularea proteinelor este însoțită de distrugerea acizilor nucleari și virusul suferă o pierdere ireversibilă a infecțiozității. În alte cazuri, capacitatea virusului de a se reproduce este păstrată. Conservat cu glicerină.

60. PCR. Principiul metodei: se identifică o genă specifică unui virus dat - o secțiune a unei molecule de ADN care poartă informații pentru sinteza unei proteine. Această genă este apoi identificată în materialul de testat folosind PCR. Această reacție permite formarea unor copii suplimentare ale genei - amplificarea unei secțiuni de ADN într-o eprubetă. În funcție de scopul studiului, specia sau genul de mo poate fi identificată. Esența PCR: molecula de ADN este încălzită la 90-94 de grade. Ceea ce duce la distrugerea legăturilor de hidrogen dintre bazele azotate ale dublei helix și apoi răcit la 52 g în prezența enzimei ADN polimerază. O creștere ulterioară a ratei duce la sinteza unei noi molecule de ADN - un șablon complementar. Această procedură se repetă de mai multe ori, rezultând fragmente mai mari. Indicarea se realizează folosind electroforeză sau o sondă ADN marcată. Componente principale: ADN-polimiraza este termostabilă; oligonucleotidă de 20 de nucleotide; trifosfați; amplificator, sticlărie și reactivi pentru electroforeză în gel de agaroză. Configurare: obținerea unei probe de ADN. Pentru a face acest lucru, materialul studiat este suspendat în tampon sau apă distilată. Adăugați OH de sodiu și mențineți timp de 7 minute. Amestecul este neutralizat. Lizatul este centrifugat timp de 10 minute pentru a sedimenta particulele mari. Lichidul supernatant este utilizat pentru PCR. PCR este amplificarea unei anumite gene a unui fragment de ADN. Apoi se topește într-un termociclor timp de 3 ore. Indicarea amplificării - proba este supusă electroforezei într-un gel de agaroză pentru a separa ADN-ul. După 30 de minute, agaroza este polimerizată în aparat și se formează găuri în agaroză. Se iau 10 μl din amestec și se amestecă cu 5 μl de colorant. Amestecul se adaugă în godeuri și se efectuează electroforeza timp de 40 de minute. Placa este îndepărtată și colorată într-o soluție de bromură timp de 10 minute. Agaroza este apoi plasată pe un transiluminator și modelele de benzi rezultate sunt fotografiate. Benzile dezvăluite de radiațiile ultraviolete sunt fragmente de ADN.

49. Metoda de infectare a culturilor celulare. Indicarea virusurilor în culturile celulare. Infecție: în acest scop sunt selectate tuburi cu un monostrat celular continuu. Mediul de creștere este drenat și celulele sunt spălate de câteva ori cu soluție Hank. În fiecare tub se adaugă 0,2 - 0,1 ml de material viral și se distribuie uniform pe întregul strat de celule prin agitare. În această formă, tuburile sunt lăsate timp de 1 până la 2 ore la 22 sau 37 de grade pentru adsorbția virusului pe suprafața celulelor. Apoi materialul viral este îndepărtat din eprubete și mediul de întreținere este turnat în eprubetă (1-2 ml). După izolarea virusului, monostratul de celule se spală de 2 ori cu soluție Hank și apoi se toarnă mediul suport. Indicaţie: conform CPD; RGAd; prin formarea plăcii; incluziuni intracelulare; RECIF; microscopia electronică

54. RTGA. RGA. RTGA: esență– atunci când virusul este amestecat cu un ser special, virusul își pierde proprietățile hemaglutinante. Goluri– identificarea virusului izolat; detectarea anticorpilor în serul de testat și titrul acestora. Componente– pentru serovarianta directă: material care conține virus, ser specific, suspensie 1% de globule roșii, soluție salină pentru diluare. Pentru retrospectiv - ser de testare, antigen standard într-o anumită doză de 4 GAE (titru de diluare a virusului) 4 GAE - 1:32. Sistem– la fiecare diluție de ser se adaugă un volum egal de antigen standard (virus) în doză de 4 GAE. Contact 30 de minute la temperatura camerei. În fiecare godeu cu diluții de ser și o doză constantă de virus în 4 ha, se adaugă un volum egal de suspensie de globule roșii. Contact 30-60 min la temperatura camerei. Contabilitate reacţiile se desfăşoară în cristae. dacă este un plus, atunci nu există aglutinare, dacă sunt minute, atunci este hemaglutinare. Titrul de anticorpi din serul de testat este diluția maximă a serului care întârzie complet aglutinarea globulelor roșii.RGA: esență: în adsorbția virusului pe suprafața globulelor roșii, ceea ce duce la lipire. Scopuri: indicare; pentru titrarea virusului în haen. Componente: virus; 0,5 suspensie de globule roșii; soluție salină pentru preparare. Schema post: pregătiți o diluție de două ori a virusului; adăugați un volum egal de suspensie de globule roșii 0,5% la fiecare dezvoltare a virusului; contact 30-60 minute la temperatura camerei. Contabilitate: in crists. 4 criste – 100% aglutinare. 3 crist - 75% . 1 cruce – aglutinare. 1 haen este diluția maximă a virusului care poate provoca aglutinarea a 50% din celulele roșii din sânge.

57. ELISA. Esența: când antigenul + serul marcat se leagă, enzima descompune substratul. Se formează un complex antigen+conjugat pentru a forma un produs de reacție colorat, evaluat la microscop cu lumină sau vizual. Scop: identificare. Componente: material sifon viral, conjugat, substrat. Schema de fixare: culitra celulară se fixează cu acetonă răcită. Se usucă și li se aplică conjugatul. Se incubează 1-2 ore la o temperatură de 37 de grade într-o cameră umedă. Se spală cu soluție salină, se clătește cu apă distilată și se usucă. Se aplică câteva picături din soluția de substrat, se incubează timp de 5-10 minute, apoi se spală în soluție salină și se clătește cu apă subțire. Contabilitate: în acest caz, adică în prezența antigenului, după aplicarea conjugatului, se formează un complex antigen plus anticorp marcat cu o enzimă. După aplicarea substratului, acesta se descompune prin acțiunea unei enzime, formând un produs colorat clar vizibil la microscopul optic.

56. RSK. Esența: legarea unui compliment de complexul antigen plus anticorp. Absența complimentului gratuit în acest sistem este apreciată de reținerea hemolizinei în sistemul indicator. Obiective: identificare; detectarea anticorpilor și a titrului acestora în serul sanguin testat. Componente: 2 sisteme – 1 (material care conține virus; ser specific;) (ser de testare; antigen standard). 2) sistem hemolitic (indicator) - 2-3% suspensie de eritrocite de oaie este un antigen; hemolizina (serul hemolitic) este un anticorp. Anticorpii corespund antigenului. Și un compliment pentru o singură reacție: dacă este primul, atunci va exista o întârziere a hemolizei când complimentul va contacta sistemul studiat. Dacă în a doua, atunci globulele roșii sunt lizate, va exista hemoliză completă. Schema de instalare: reacția este mai întâi efectuată în sistemul studiat, apoi sistemul indicator este adăugat în aceeași eprubetă. Contabilitate: RSC pozitiv – hemoliză întârziată. Negativ – hemoliză completă.

7. Proteine ​​virale. Constă din aminoacizi. Compoziția proteinei virale depinde de ordinea de alternanță a aminoacizilor, această ordine este determinată de informațiile genetice conținute în genomul viral. Proteinele virale sunt împărțite în structurale și nestructurale. Proteinele structurale fac parte din virionii maturi. B non-structurale nu sunt incluse în virionii maturi, dar sunt obligatorii în anumite stadii de reproducere. StructuralNestructurale

8. Enzime virale. Sunt proteine ​​în natură. Ele pot fi asociate direct cu virionul, dar nu sunt asociate - nu sunt structurale. în ADN Pentru ARN: ADN-polimiraza dependentă de ARN - nu este prezentă în celulă, este necesară pentru „-” care conține ARN și ADN, care în familia vir a retroviridae conține o enzimă care transduce genomul viral se numește ADN-polimiraza dependentă de ARN. Această enzimă are denumirea: revertază, revers transcriptază. Enzime implicate în formarea proteinelor virale: proteaze, protein kenaze.

52. RN.Esență: Când virusul interacționează cu un anumit ser, virusul își pierde proprietățile infecțioase, capacitatea de a se multiplica în celule. Obiective: identificarea virusului izolat, detectarea anticorpilor în serul sanguin și titrul de anticorpi. Componente: material care conține virus, ser specific, model biologic. Dacă retrospectivă: ser de sânge testat, antigen standard, model biologic. Schema generală de configurare: se amesteca antigen si anticorp, contact 30-40 minute, maxim 2 ore la temperatura de 37-38 grade; un amestec de antigen plus anticorp este utilizat pentru a infecta un model biologic; observatie si contabilitate. Contabilitate: pH-ul pozitiv înseamnă viu, pH-ul negativ înseamnă mort.

53. RDP.Esență: același antigen și anticorp plasate la aceeași distanță unul de celălalt într-un gel de agar difuzează unul spre celălalt, formând un precipitat sub formă de dungă albă la punctul de întâlnire. Obiective: identificarea virusului izolat, detectarea anticorpilor în serul de testat. Componente: material care conține virus, ser specific, gel de agar. Pentru retrospectivă: test de ser sanguin, antigen standard, gel de agar. Schema de etapă: straturile de agar se prepară pe o lamă de sticlă, se prepară godeurile, componentele de reacție se adaugă în godeuri conform unei anumite scheme, sticla cu reacția este plasată într-un termostat la 37-38 C. Reacția se înregistrează după 48 de ore. O reacție pozitivă este formarea unei benzi albe de precipitare.

55. RGAd, RTGAd. RGAd: Esență:în adsorbția eritrocitelor pe suprafața celulelor infectate cu virus. Obiective: indicație de virus. Componente: cultura celulară infectată cu material care conține virus; suspensie de globule roșii . Schema de etapă: preinfectează o cultură celulară cu un singur strat cu materialul de testat. Culturile sunt drenate în mediul de cultură suport. Se spală cu soluție Hanks. Se adaugă o suspensie de globule roșii. Contact 5-15 minute la temperatura camerei. Contabilitate: efectuată la microscop cu lumină. Pozitiv – celulele roșii sunt adsorbite pe celule; negativ – globulele roșii plutesc liber. RTGAd: esenta: în legarea anticorpilor specifici la suprafața celulelor infectate cu virus, ceea ce duce la inhibarea adsorbției pe celulele eritrocitare. Obiective: identificarea virusului izolat. Componente: cultura de celule contaminate; ser specific; suspensie de globule roșii. Schema de etapă: o cultură celulară cu un singur strat este preinfectată cu un material inițial cu un singur strat care conține virus. Se toarnă într-un mediu de hrănire și se adaugă 0,8 ml de ser specific. Contact 20-30 minute. Se adaugă o suspensie de globule roșii. Contact 5 – 15 minute. Contabilitate: Pentru control, trebuie să instaleze RGA. Contabilizarea în tuburi experimentale: pozitiv - globulele roșii plutesc liber, negativ - globulele roșii plutesc și ele liber. Contabilizarea în tuburi de control cu ​​pozitiv – adsorbție, negativ – flotant liber.

6. Acizi nucleici virali.+ ARN este un acid nucleic viral care are și funcția de ARN informativ. Informațiile despre sistemul de sinteză a proteinelor din ARN+ sunt imediat transferate în ARN-ul genomic fără transcripție. -Virușii care conțin ARN sunt viruși cu ARN monocatenar care nu au funcția de ARN mesager în astfel de virusuri, sinteza ARN mesager (transcripția) are loc pe șablon minus catenele de ARN genomic folosind o enzimă specifică virusului strâns asociată; cu gnome ARN, ARN-polimiraza dependentă de ARN. Există viruși care conțin atât catene de ARN plus, cât și minus, acestea includ adenovirusuri și paramixovirusuri. Informațiile genomice din ADN-ul dublu catenar sunt codificate pe ambele catene. Acizii nucleici sunt reprezentați de polinucleotide formate din nucleotide individuale. Cantitatea lor în acid nucleic variază. Fiecare nucleotidă constă din 3 subunități: un reziduu de acid fosforic, un carbohidrat și o bază azotată.

9. Structura virusurilor. Forme de bază. Tipuri de simetrie. Structura: ADN: de obicei dublu catenar, informațiile genelor sunt codificate pe ambele catene. ADN-ul viral poate fi aranjat într-o manieră liniară, circulară. Poate fi monocatenar. ARN virale: adesea monocatenar, mai rar dublu catenar. Aranjate liniar, în mod circular, fragmentate. De regulă, ele constau din 11-12 fragmente. ARN-ul vir monocatenar poate fi de două tipuri: ARN-uri cu catenele plus și minus (genom negativ). Spirală Acesta este un tip de sim în care capsomerii sunt localizați în jurul acidului nucleic într-o manieră elicoidală. Virușii mari și unii viruși de dimensiuni medii au acest tip de sim. Forma: în formă de tijă, poliformă, sferică, ovală. La virusurile în formă de tijă, capsida este formată din capsomeri dispuși în jurul acidului nucleic în spire spiralate de același diametru, strâns adiacente între ele. Tip cubic: Majoritatea virușilor mici și o proporție semnificativă a virușilor de dimensiuni medii îl au. Forma unor astfel de viruși este sferică. Capsomerii capsidei sunt localizați în jurul nucleilor acizi ca în jurul unui corp izometric obișnuit. Învelișul proteic al unor astfel de viruși se apropie de forma unui icosaider, o față obișnuită cu 20 de fețe. Combinate tip de simetrie: constă din spirală și cubică. Toți fagii și unii virusuri complexe din familia coxviridae îl au. Au o înveliș exterioară cubică și o înveliș capside spirală. Fagii au un cap icoseindric și un proces spiralat.

18. Principalele etape ale primei faze a reproducerii virale. Aceasta este faza de infectare a celulei, in aceasta faza virionul trebuie sa intre in contact cu celula, sa patrunda in celula si sa se dezbrace. Primul stadiul de adsorbție a virionilor pe suprafața celulei se poate produce în două moduri: fizico-chimic (nespecific); receptor (specific). Calea fizico-chimică este determinată de interacțiunea forțelor electrostatice de suprafață care apar între grupurile de proteine ​​virale încărcate pozitiv și grupările de carboxine, sulfat și fosfat încărcate negativ ale peretelui celular. Receptor bazat pe interacțiunea specifică a receptorului proteic viral cu receptorii complementari de pe suprafața peretelui celular. Receptorii virușilor și receptorii celulelor sensibile la un anumit virus au o configurație complementară (ca o cheie a unui lacăt). Dacă celula nu este sensibilă, atunci reabsorbția nu va avea loc niciodată. Al doilea penetrare – apare în moduri diferite pentru diferiți virusuri: cu ajutorul viropexis; prin topirea scoicilor. Viropexis– această cale este similară cu pinocitoza. În primul rând, la locul de adsorbție pe suprafața celulei, are loc invaginarea peretelui celular al membranei, apoi marginile membranei se închid cu interiorul celulei, virionul cu toate membranele sale apare în vacuola celulară. De fuziune- în acest caz, zonele învelișului viral și ale membranei celulare care se primesc reciproc sunt topite sub acțiunea enzimelor specifice virusului și doar acidul nucleic viral apare în celulă, în timp ce rămășițele virusului sunt încorporate în celulă. plicul celular. Al treilea etapă– deprotenarea – eliberarea din membrane – depinde de căile de intrare a virusului în celulă. Dacă deprotonizarea nu este izolată ca etapă separată prin fuziunea membranelor, aceasta are loc concomitent cu pătrunderea virusului. Dacă pătrunderea se face prin viropexis, atunci eliberarea acidului nucleic viral din plicuri începe după distrugerea proteinelor, lipidelor și grăsimilor care alcătuiesc plicurile virale. Toate etapele depind de temperatură.

20. Transcriere. Aceasta este rescrierea informațiilor genetice din acidul nucleic viral în ARN-ul informației virale, nou sintetizat conform legilor codului genetic. (virusul trebuie să prezinte proteina celulei care se sintetizează și să fie convertit în ARN). Produsul final al transcripției este ARN-ul mesager viral. ARN-urile + monocatenar nu au transcrieri, dar ARN-ul lor viral genomic are informația vir ARN. În ARN-ul monocatenar, genomul nu poate îndeplini funcția de ARN mesager și ARN-ul său este transflexat folosind enzima specifică virusului ARN-polimiraza dependentă de ARN. DESEN!

21. Difuzare. Acesta este procesul de traducere a informațiilor genetice conținute în ARN-ul mesager viral într-o anumită secvență de aminoacizi. O translație are loc atunci când cele patru baze încorporate în ARN-ul mesager viral sunt convertite într-un cod de 20 de aminoacizi. Produsul final al traducerii sunt proteinele virale. Sinteza proteinelor are loc pe ribozomii celulari. Se compune din 3 faze: inițierea traducerii și începutul traducerii; continuare; terminare – sfârșit de difuzare. Inițierea se bazează pe formarea unui complex de componente necesare pentru începerea translației, adică complexul de inițiere se bazează și pe recunoașterea ribozomului de către ARN-ul mesager viral și legarea acestuia de anumite zone numite capac. Aceasta este guanina metilata. După ce a recunoscut capacul, ribozomul alunecă în jos pe molecula de ARN mesager până ajunge la locul unde începe decodificarea informațiilor.

5. Compoziția chimică a virusurilor. Virușii sunt formați din acizi nucleici (ADN, ARN). Acizii nucleici sunt reprezentați de polinucleotide formate din non-nucleotide individuale. Fiecare nucleotidă constă din 3 subunități: un reziduu de acid fosforic, un carbohidrat și o bază azotată. Proteine ​​virale : Compus din aminoacizi. Compoziția proteinei virale depinde de ordinea de alternanță a aminoacizilor, această ordine este determinată de informațiile genetice conținute în genomul viral. Proteinele virale sunt împărțite în structurale și nestructurale. Proteinele structurale fac parte din virionii maturi. B non-structurale nu sunt incluse în virionii maturi, dar sunt obligatorii în anumite stadii de reproducere. StructuralÎn funcție de localizarea lor în virion, proteinele virale sunt împărțite în următoarea grupă: proteine ​​capside - în capside; supercapsid b – în supercapsid (preponderent proteine, există și grăsimi și carbohidrați); proteinele matricei – proteine ​​ale stratului membranar; proteinele nucleului viral sunt reprezentate de enzime. Nestructurale– în funcție de funcțiile pe care le îndeplinesc, se împart în: regulator al expresiei genomului viral; inhibitori ai biosintezei celulare; inductori de distrugere a celulelor; precursori de proteine ​​virale proteine ​​vir structurale; unele enzime virale nu fac parte din virionii maturi. Lipide: sunt incluse în principal într-o parte a învelișului surercapside al virionului în virusurile complexe. Toate acestea nu sunt codificate de genomul vir și sunt de origine celulară. Sunt reprezentate de fosfolipide și glicolipide. Carbohidrați: fac parte din supercapside obol, nu sunt codificate de genomul viral și sunt de origine celulară, reprezentate de glicoproteine ​​și glicolipide . Enzime virale: Sunt proteine ​​în natură. Ele pot fi asociate direct cu virionul, dar nu sunt asociate - nu sunt structurale. Enzimele polimiraze timpurii și replicaze timpurii iau parte la etapa de schimbare a informațiilor. Sunt clasificați ca inhibitori ai biosintezei celulare. Enzime care transhibează genomul viral: în ADN care conțin viruși - ARN-polimirazele dependente de ADN sunt prezente în celulă în unele cazuri este accesibilă virușilor, în altele nu; Poate fi de origine celulară sau virală. Virușii care conțin ADN care se reproduc în nucleu sunt de origine celulară. În citoplasmă - origine virală - specifică virusului.

Pentru ARN: ADN-polimiraza dependentă de ARN - nu este prezentă în celulă, este necesară pentru „-” care conține ARN și ADN, care în familia vir a retroviridae conține o enzimă care transduce genomul viral se numește ADN-polimiraza dependentă de ARN. Această enzimă are denumirea: revertază, revers transcriptază. Enzime implicate în formarea proteinelor virale: proteaze, protein kenaze.

13. Bacteriofagi. Virusul bacteriilor. Sunt cunoscuți bacteriofagi ADN și ARN. Majoritatea ADN-ului fagilor este dublu catenar. Fagii ARN sunt monocatenar. Acidul nucleic fagic este înconjurat de o capsidă poliedrică (cap), de care la mulți fagi este atașat un apendice (coadă). Diametrul capetelor este de aproximativ 60-95 nm iar lungimea proceselor este de 250 nm cu o grosime de 10-25 nm. Procesul servește ca o structură de atașare la bacterie. Interacțiunea dintre b și celulele microbiene este un proces biologic complex, al cărui rezultat depinde de proprietățile fagilor și se manifestă prin liza celulelor bacteriene. bacteriofagii sunt folosiți pentru diagnosticare (antrax); pentru tratamentul infecțiilor bacteriene; pentru prevenirea inf (salmoneloza). DESEN!

22. Replicarea ADN-ului viral.

23. Replicarea ARN viral. ARN monocatenar cu genom negativ:

25. Asamblarea virionilor și eliberarea lor din celulă.

: explozie, ruptură, distrugerea celulei în care s-au format virionii maturi (viruși simpli), celula moare. Structurile complexe ies prin înmugurire, adică ies prin peretele celular și se desprind. În acest caz, celula nu moare imediat, ci atunci când rezervele sale sunt epuizate

19. Faza a doua a reproducerii.Etapa eclipsei: stadiul schimbării informaţiei. În această etapă, funcția genomului celular este suprimată datorită faptului că acidul nucleic blochează virusul, iar enzimele virale blochează aparatul genetic al celulei și sistemele de sinteză ale celulei. Acest lucru face ca celula să nu mai reproducă propriile componente celulare și să treacă la reproducerea componentelor externe. Replicasele timpurii și polimirazele timpurii sunt implicate aici. Transcriere: Aceasta este rescrierea informațiilor genetice din acidul nucleic viral în ARN-ul informației virale, nou sintetizat conform legilor codului genetic. (virusul trebuie să prezinte proteina celulei care se sintetizează și să fie convertit în ARN). Produsul final al transcripției este ARN-ul mesager viral. ARN-urile + monocatenar nu au transcrieri, dar ARN-ul lor viral genomic are informația vir ARN. În ARN-ul monocatenar, genomul nu poate îndeplini funcția de ARN mesager și ARN-ul său este transflexat folosind enzima specifică virusului ARN-polimiraza dependentă de ARN. DESEN!Difuzare: Acesta este procesul de traducere a informațiilor genetice conținute în ARN-ul mesager viral într-o anumită secvență de aminoacizi. O translație are loc atunci când cele patru baze încorporate în ARN-ul mesager viral sunt convertite într-un cod de 20 de aminoacizi. Produsul final al traducerii sunt proteinele virale. Sinteza proteinelor are loc pe ribozomii celulari. Se compune din 3 faze: inițierea traducerii și începutul traducerii; continuare; terminare – sfârșit de difuzare. Inițierea se bazează pe formarea unui complex de componente necesare pentru începerea translației, adică complexul de inițiere se bazează și pe recunoașterea ribozomului de către ARN-ul mesager viral și legarea acestuia de anumite zone numite capac. Aceasta este guanina metilata. După ce a recunoscut capacul, ribozomul alunecă în jos pe molecula de ARN mesager până ajunge la locul unde începe decodificarea informațiilor. Replicarea ADN-ului viral: Replicarea ADN-ului dublu catenar: O moleculă de ADN dublu catenar este mai întâi separată în 2 catene separate folosind enzime nucleaze celulare, apoi ADN-ul de informații virale este format pe una dintre catenele de ADN viral a cărei matrice este. Acest lucru se întâmplă cu ajutorul unei ARN polimeraze dependente de ADN-uri specifice virusului sau enzimei celulare. Apoi, ARN-ul informator viral se deplasează în ribozomul celular, unde are loc translația cu formarea de proteine ​​​​și enzime virale, inclusiv enzima ADN-polimiraza. Folosind ADN-polimiraza, oa doua catenă complementară de ADN este construită din nucleotidele celulare. În acest fel, sunt sintetizate noi molecule de ADN dublu catenar. Replicarea ADN-ului monocatenar: Catenele simple de ADN au polaritate pozitivă. Cu ajutorul enzimei ADN-polimirazei dependente de ADN-uri specifice virusului, pe matricea ADN monocatenar virală se formează o catenă minus complementară de ADN. Se sintetizează o structură cu dublu helix, care se numește formă replicativă. Apoi, pe șablon, catenele minus ale formei replicative formează plus catenele de ADN monocatenar prin deplasarea catenelor plus de ADN din forma replicativă. Replicarea ARN viral: ARN monocatenar cu genom negativ: Imediat după pătrunderea în celulă, transcripția are loc cu formarea de ARN inf viral plus. În aceasta este implicată enzima specifică virusului ARN-polimiraza dependentă de ARN. ARN-ul Vir inf este apoi tradus pentru a forma proteine ​​și enzima ARN-polimiraza. Ulterior, cu ajutorul ARN-polimirazei, pe matrice se formează catenele de ARN minus monocatenar fiice plus catenele de ARN informațional. ARN monocatenar cu genom pozitiv: După pătrunderea în celulă, plus ARN-ul se leagă imediat de ribozomi unde este tradus pentru a forma proteine ​​și enzime, inclusiv enzima ARN replicază. Apoi, sub acțiunea ARN replicazei, se formează o formă replicativă. Pe șablon, ARN-ul minus al formei replicative creează o imagine a catenelor de ARN plus prin deplasarea lor din forma replicativă. Replicarea ARN viral dublu catenar: sinteza ARN-urilor virale mesager are loc pe un model de ARN dublu catenar folosind enzima ARN-polimiraza dependentă de ARN. Transcriere pe un șablon de catenă de ARN, fiecare fragment este transcris separat. Apoi, ele sunt traduse pentru a forma proteine ​​și enzima ARN-polimiraza cu ajutorul acestei enzime pe catenele plus de ARN mesager pentru a forma catene minus complementare de ARN, adică ARN dublu catenar. Asamblarea virionilor și eliberarea lor din celulă: 2 strategii de asamblare, maturare și ieșire dintr-o celulă infectată: implementarea asamblarii și maturării în interiorul celulelor; combinație a ultimei etape de asamblare a virionului cu ieșirea din celula infectată.

Asamblarea se realizează prin agregare simplă, adică combinarea unei proteine ​​vir cu un acid nucleic are loc sub influența factorilor fizico-chimici, adică are loc auto-asamblarea. Se bazează pe unificare și recunoaștere specifică non-proteică și proteină-acid nucleic. Se formează o nucleocapsidă. Pentru virușii simpli, aici se termină procesul de auto-asamblare. În virușii complexi, procesul de auto-asamblare se desfășoară diferit. O parte din proteină merge la formarea nucleocapsidei, care se formează ca în virușii simpli, iar o parte din proteine ​​se deplasează în membrana celulară. Nucleocapsidul format se deplasează ulterior acolo. Și formarea unei învelișuri de supercapside are loc atunci când virionul părăsește celula, adică nucleocapsidul este acoperit deasupra cu proteine ​​care s-au mutat în membrana celulară și la ieșirea grăsimilor și carbohidraților din celulă sunt încorporați în acest înveliș exterior. . Există două moduri de a ieși: explozie, ruptură, distrugerea celulei în care s-au format virionii maturi (viruși simpli), celula moare. Structurile complexe ies prin înmugurire, adică ies prin peretele celular și se desprind. În acest caz, celula nu moare imediat, ci atunci când rezervele sale sunt epuizate.

62-63. Variola de oaie și capră(genul Caprippoxvirus). Ectima contagioasă la oi și capre(genul Parapoxvirus).Familie: poxviridae. conţinând ADN. Caracteristici ale reproducerii: genomul virusului este foarte mare Chiar și în celulele infectate, replicarea este finalizată după 6 ore. Penetrarea are loc prin fuziunea membranelor virale și celulare. După penetrare, ADN-ul dublu catenar este divizat și replicarea începe pe ambele catene de ADN simultan. Mai mult, sinteza componentelor virale are loc în citoplasma celulelor. Ansamblul virionului în citoplasmă. Ieși prin înmugurire.

2. Rolul virusurilor în patologia infecțioasă a animalelor. În prezent, bolile virale sunt de mare importanță în patologia infecțioasă a animalelor, oamenilor și plantelor. Rolul lor crește odată cu reducerea și eliminarea bolilor bacteriene, micotice și protozoare. Bolile virale reprezintă aproximativ 80% în medicină și 50% în medicina veterinară. Există peste 500 de boli cunoscute cauzate de viruși. Originea virală a fost stabilită în astfel de boli deosebit de periculoase precum febra aftoasă, pesta bovină, pesta porcină etc. Virologia poate fi împărțită în generală și specifică. Studii generale natura și originea virusurilor, clasificarea, structura și compoziția chimică a acestora, genetica și selecția, metodele de diagnostic și prevenire, bazele imunității antivirale. Private vir studiază numele și poziția sistematică a agenților patogeni specifici, structura, dimensiunea și stabilitatea virionului, terapie, metode de diagnostic și prevenire.

1. Istoria dezvoltării. Prima perioadă începe din cele mai vechi timpuri până în 1892. În această perioadă, virologia ca știință independentă nu a existat. Bacteriologii au studiat boli cu etiologie necunoscută. A doua perioadă - formarea virologiei ca știință în sine - acoperă 1892-1950. această perioadă a început odată cu descoperirea botanistului rus D.I. Ivanovsky (1898) privind filiabilitatea agentului cauzal al bolii mozaic de tutun. Ivanovsky, studiind etiologia bolii tutunului, a stabilit că această boală este cauzată de un microorganism minuscul special care trece prin filtre bacteriene. Este invizibil la microscopul optic. Nu crește pe medii de creștere artificială. Ulterior, MO similare au fost izolate de la alte plante, precum și de la animale și oameni. Au fost uniți într-un grup independent - ultravirusuri. În anii 1930, embrionii de pui au început să fie utilizați în practica virologică. În 1956, Stanley a reușit să împartă virusul în componentele sale principale - proteine ​​și acid nucleic. La sfârșitul anilor 40 ai secolului al XX-lea, crearea de micro-uri electronice Rudenberg. Iar cea ușoară a fost creată de Leeuwenhoek. Oamenii de știință sovietici care au contribuit la virologie: Jdanov, Lihachev, Syurin.

48. Metodă de obținere a culturilor celulare primare tripsinizate monostrat. Celulele cu un singur strat sunt necesare pentru a indica virusul. Se obține din țesuturi sau organe prin tratarea acestora cu tripsină. Cele monostratificate sunt împărțite în 4 grupe: subculturi diploide sau semi altoate; Țesutul este zdrobit și dispersat cu enzima tripsina. Apoi tripsina este îndepărtată prin centrifugare și se adaugă un anumit volum de mediu nutritiv lichid în sedimentul rezultat. Celulele sunt crescute într-un singur strat - un monostrat - pe suprafața interioară a sticlei. Există o nevoie constantă de organe de la animale sănătoase. ȘI se folosesc embrioni de 9-112 zile. Ovoscopia. Prelucrarea cochiliei. Cu ajutorul foarfecelor, tăiați coaja deasupra marginii pugii. Embrionul este îndepărtat steril. Spălați cu soluția lui Hank. Se pregătește un sac piele-muscular. Spălați cu soluția lui Hank. Țesătura este mărunțită cu foarfece. Se transferă într-un balon de tripsinizare. Balonul se pune pe un agitator magnetic timp de 15 minute. Suspensia este răcită într-un vas cu gheață. Se filtrează într-un recipient de balon. Suspensia de celule este centrifugată timp de 10-15 minute. Tripsina este eliminată. Din sedimentul celular se prepară o masă combinată, se toarnă în tuburi de 1 ml și celulele sunt cultivate.

47. Soluții de bază și medii nutritive.După origine Există medii de hrănire naturale și medii de hrănire artificiale. Naturale - din cele biologic active: vitalitate embrionară, alantoică plus adaos de soluții echilibrate de sare. Artificial - preparat din componente individuale. Cel mai adesea se folosesc medii de alimentare universale sau pot exista unele speciale. Universal este mediu 199 și Igla mediu. Compoziția mediilor de artă ar trebui să includă aminoacizi, vitamine, enzime și soluții echilibrate de sare, uneori un indicator (roșu fenol). Esența indicatorului este detectarea virusului prin schimbarea culorii. Pe parcursul vieții celulei, pH-ul se schimbă în partea acidă. Într-un mediu acid, culoarea indicatorului se schimbă de la roșu purpuriu la galben. Serul sanguin normal este uneori adăugat în mediul nutritiv într-un volum de 100 la sută din volumul mediului nutritiv. Serul de sânge se numește factor de creștere. Se adauga pentru proliferarea celulara, numai in mediile de crestere . După scopul utilizării: mediu de creștere – ser inclus; de susținere – fără ser. Soluții echilibrate de sare: toate sunt derivate ale soluției saline. Folosit ca bază pentru prepararea mediului de groapă și pentru toate manipulările cu culturi celulare (pentru a spăla ceva). Acestea sunt soluțiile Hanks și Earle. Soluții de dispersie: pentru separarea celulelor de altele și a celulelor din sticlă. Soluții de pepsină, tripsină. Din sticlă - soluții versine. Soluția de versine leagă cationii de calciu.

50. Titrul virusului. Titrul virusului este cantitatea de virus, adică doza pe unitatea de volum de material care conține virus. 3 metode de titrare: 1 metoda: titrarea virusului în funcție de efectul infecțios al virusului cu efect evaluat statistic. Conform metodei de citire și menchu ​​​​sau după Kerber. Titrul este exprimat în doze de 50%. Acesta este ED50. Pentru această metodă de titrare se poate folosi orice model biologic, dar acest model trebuie să fie sensibil la virusul care urmează să fie titrat (culturi celulare, embrioni, animale de laborator). În funcție de efectul infecțios al modelelor biologice infectate, acestea sunt împărțite în următoarele: recunoscute clinic; în funcție de modificările patomorfologice; la moartea modelului; prin acumularea de hemaglutinină. Rezultatele muncii depind de doza de virus. S-a stabilit că doza de virus care provoacă 50 la sută din efectul infecțios este cea mai puțin susceptibilă la fluctuații și este cea mai determinabilă dintre toate dozele posibile. Titrul este exprimat în doze eficiente de 50%. Acesta este un DE de 50. În funcție de modelul biologic utilizat și de efectul obținut, doza de 50 la sută poate fi exprimată în următoarele unități: LD 50 – Aceasta este 50% din doza letală primită pentru laborator, care este vie în ceea ce privește efectul letal. ID 50– aceasta este o doză infecțioasă de 50 la sută determinată pentru ca laboratorul să fie în viață pe baza semnelor clinice sau a modificărilor patomorfologice. ELD 50- aceasta este o doză letală embrionară de 50% determinată pe embrionii de pui în funcție de anul rezultatului. EID 50– aceasta este o doză infecțioasă embrionară de 50 la sută determinată la embrionii de pui de modificări patomorfologice și acumularea de hemaglutinină. TsPD 50– aceasta este o doză citopatogenă de 50 la sută determinată în culturi celulare prin CPD. Dacă în sistemele infectate nu observăm 50 la sută din efectul că ID 50, atunci titrul se calculează prin citire și meniu: lg LD 50 = lg ECD - (% ani de ECD - 50%) / (% ani de ECD - % ani de ECD) TOATE ACESTEA MULTIPLITE CU factorul de diluție lg. Metoda 2 : asupra efectului infectios al virusului cu o evaluare a efectului unic. Cu metoda de formare a plăcii în cultura celulară, există un singur efect. Exprimat în unități formatoare de variolă sau unități formatoare de plăci PFU. Se prepară o diluție de 10 ori a virusului; selectați un model biologic sensibil; În fiecare diluție a virusului, cel puțin 4 embrioni sunt infectați. Titrul este calculat folosind formula T=a împărțit la V*n. a - numărul mediu de urme sau plăci. V este volumul conținutului de material = 0,2. n este gradul de diluare a virusului. Metoda 3: în funcție de efectul hemaglutinant al virusului în GAEN. Au pus RGA.

38.Principii de diagnostic de laborator al infecţiilor virale.

Studiile de laborator joacă un rol important în stabilirea diagnosticului bolilor infecțioase, prescrierea terapiei etiotrope și monitorizarea eficacității tratamentului. Procesul de diagnosticare specifică de laborator se bazează pe identificarea agentului patogen și a răspunsului organismului uman în timpul procesului infecțios. Se compune din trei etape: colectarea materialului, transportul acestuia (pinten nr. 39) și studierea lui în laborator: 1) Metoda virologică cuprinde două etape principale: izolarea virusurilor și identificarea acestora. Pentru a izola virusurile, se folosesc culturi celulare, embrioni de pui și uneori animale de laborator. Prezența virusului în culturile infectate este determinată de dezvoltarea degenerării celulare specifice, adică. efect citopatogen, detectarea incluziunilor intracelulare, precum și pe baza detectării unui antigen specific prin imunofluorescență, reacții pozitive de hemadsorbție și hemaglutinare. Virușii sunt identificați prin metode imunologice: reacția de inhibare a hemaglutinarii, fixarea complementului, neutralizarea, precipitarea gelului, imunofluorescența. 2) Reacții serologice; 3) Metoda imunologică (biotestele); 4) ELISA și PCR. După primirea rezultatelor examinării și luând în considerare datele epidemiologice și clinice, se stabilește un diagnostic final.

39. Preluarea, pregătirea și transmiterea brevetului. Material pentru virolog. Cercetare.

Colectarea, transportul și examinarea brevetului. materialul este reglementat de legislația veterinară. La luare, se ia în considerare tropismul virusului - localizarea preferată a virusului într-o anumită boală și patogeneza. E timpul să ajungi într-un impas. material până la finalul cercetării sale - 2-4 ore. Dacă aveți nevoie de mai mult timp, păstrați-l (metode chimice - soluție de glicerol 50%, fizic - congelare), dar nu pentru luminiști. microscopie. Transport la special containere cu însoțitor document si curier. Pregătirea implică extragerea virusului din celule. Lichid material – filtrare și centrifugare. Pentru a curăța bacteriile - bacteriene. filtre si antibiotice (500-2000 unitati la 1 ml), pentru fungi - fungicide (25 unitati la 1 ml), se pastreaza 30-40 minute, se inocula cu pitata. mediu (aerobi – MPA, MPB, MPZh, anaerobi – Kitta-Tarozzi, ciuperci – Chapeka, Saburo). Material brevetat dens: 1) luați material patentat 1-1,5 g; 2) se toaca cu foarfeca; 3) se spală cu steril. sticlă sau nisip într-un mortar; 4) suspensie 10% cu soluție Hanks; 5) congelați și dezghețați de 2 ori; 6)filtrare printr-un filtru de tifon; 7) centrifugare (3000 rpm, 15 min); 8) lichid supernatant – material care conține virus, este testat pentru bacterii (medii nutritive), se adaugă antibiotice și fungicide.

40. Metoda microscopică de cercetare în virologie.

1. Microscopie cu lumină: 1) pentru detectarea virusului variolei (metoda de argint Morozov); 2) Pentru a detecta corpuri de incluziune (aceasta este o acumulare de virioni sau din părți sau produse ale reacției celulei la virus; aceștia pot fi intranucleari și citoplasmatici); 3) detectarea virusului CPD (rotunjire, fragmentare, moarte); 4) detectarea simplastelor; 5) lucrul cu C/C; 6) evaluare de către serolog. reacții (ELISA, RGAd, RTGAd). 2. Microscopia de luminescență: esența este că atunci când sunt iradiați cu raze UV, atomii sunt excitați, apoi intră în starea inițială cu eliberarea de energie sub formă de radiație luminoasă, intensitatea acesteia este evaluată în cruci (verde-smarald = ++ ++; verde = ++; galben = +; înainte de iradiere, preparatul este fluorocrom. Complex - MFA Esența MFA este specifică. interacțiunea anticorpului cu serul marcat cu fluorocrom (conjugat). 3.Microscopia electronică: 1) detectarea oricărui virus; 2) studiul dimensiunii, formei, structurii, tipului de simetrie, reproducerii acestuia; 3) studiul interacțiunii virusului cu celula.

Laboratoarele microbiologice fac parte din centrele de supraveghere sanitară și epidemiologică de stat (TSGSEN), din spitalele de boli infecțioase și marile, dispensarele dermatovenerologice și de tuberculoză. În funcție de apartenența departamentală, lucrările de diagnosticare se desfășoară în laboratoare bacteriologice, virusologice, micologice etc., care sunt reglementate de instrucțiuni și legislație relevante. În conformitate cu aceste acte legislative, fiecare dintre laboratoare poate lucra doar cu anumite grupe de microorganisme.

Laboratoarele bacteriologice ale Universității Medicale de Stat Centrale lucrează cu microbi din grupele III și 1U, efectuând diagnostice etiologice ale bolilor infecțioase de natură aeriană, intestinală, purulent-inflamatoare etc.

Laboratoarele de virologie efectuează diagnostice virusologice ale bolilor cauzate de viruși (gripa, poliomielita, herpes etc.), precum și chlamydia (ornitoză, boli genito-urinale etc.) și rickettsia (febră Q, tifos etc.).

Laboratoarele de infecții deosebit de periculoase diagnostichează infecții microbiene deosebit de periculoase (ciumă, holeră, antrax, bruceloză, tularemie etc.), iar unele dintre ele de etiologie virală (Marburg, Ebola, variola etc.). Lucrarea se desfășoară conform unor reglementări deosebit de stricte.

Grupa dermatovenerologică de boli și tuberculoză sunt diagnosticate în dispensarele corespunzătoare.

Laboratoare bacteriologice TsGSEN ar trebui să fie amplasat în clădiri standard sau spații proiectate pentru volumul de muncă efectuat, în conformitate cu scopul. Fiecare laborator bacteriologic trebuie să aibă un set complet de unități necesare pentru el : este posibil un registru pentru primirea testelor și eliberarea rezultatelor, cutii pentru lucrul cu bacterii din diferite grupuri, o cameră pentru imunodiagnostic și teste genetice moleculare, săli pentru pregătirea mediilor de cultură, sterilizare, spălare, un vivarium cu boxe pentru animale sănătoase și de experiment.

Fiecare cameră este dotată cu echipamente și echipamente adecvate.

Camera de sterilizare trebuie sa contina un sterilizator cu abur de un anumit model – vertical sau orizontal etc.

În ceea ce privește echipamentele pentru creșterea, depozitarea microorganismelor și alte lucrări, trebuie să aveți:

Frigidere pentru depozitarea separată a culturilor și a altor preparate biologice, conform instrucțiunilor.

Centrifuge pentru sedimentarea substanțelor corpusculare, inclusiv a microorganismelor. Centrifugele trebuie să fie refrigerate.

Termostate pentru creșterea culturilor bacteriene la o temperatură dată.

Micronaerostate, pentru creșterea bacteriilor numite anaerobi în condiții fără oxigen.

Distilator pentru producerea apei distilate.

Aparat pentru realizarea dopurilor din tifon de bumbac de diferite dimensiuni.

În încăperile de box este necesar să aveți: microscoape biologice de imersie (inclusiv un iluminator pentru dispozitiv de contrast de fază, un condensator cu câmp întunecat), băi de apă, frigidere, un set de instrumente (bucle bacteriologice, ace, bisturii, pensete, spatule, etc.), seturi de coloranți, alcool, reactivi, hârtie de filtru, creioane pentru scris pe sticlă, acizi, alcalii, lămpi cu alcool și arzătoare cu gaz. Borcane cu solutie dezinfectanta (semnate, cu data prepararii acestei solutii dezinfectante). Sticlărie : pipete, eprubete, baloane, flacoane, vase Petri, saltele, paster etc.

Laboratorul trebuie să aibă o anumită aprovizionare cu medii de cultură comerciale, sisteme de testare și seruri de diagnosticare și diverse seturi de medicamente pentru diagnosticare.

Câteva reguli pentru lucrul în laboratoarele microbiologice:

1. Toți angajații lucrează în halate medicale, șepci și papuci. Dacă este necesar, purtați o mască.

2. Fumatul, mâncatul și apă potabilă sunt interzise în laborator, cu excepția zonelor special amenajate.

3. Locul de muncă este păstrat în ordine exemplară.

4. Dacă materialul infectat ajunge pe o masă, podea sau altă suprafață, este necesar să se trateze zona cu o soluție dezinfectantă.

5. Depozitarea, expedierea, eliberarea culturilor de microorganisme se efectuează conform prevederilor.

6. La sfârșitul lucrului, spălați-vă bine mâinile cu săpun. Dacă este necesar, mâinile pot fi tratate cu una dintre soluțiile dezinfectante etc.

Laboratoare de virologie. Acestea trebuie să fie complet izolate de alte unități. Există anumite diferențe în structura laboratoarelor de virologie, în funcție de specializare, dar există diviziuni principale : congelator, spalare, dezinfectare, culturi de celule pure si infectate, cutii pentru lucrul cu virusi, o camera pentru studii imunodiagnostice, un vivarium, o camera pentru embrioni de gaina - curata si infectata.

Laboratorul de virologie trebuie să aibă : vestiar - pentru schimbarea hainelor, pantofilor, gresie acoperite cu linoleum. Ferestre acoperite cu plasă. Lămpi cu ultraviolete. Sunt necesare frigidere - la 4 o C si un ultrafrigider la -20-40 o C sau mai mult, mortare de portelan, omogenizatoare, pistil, unelte (foarfece, ace, seringi, bisturii, pensete etc.). Centrifuge cu răcire până la 5-6 mii vol. și ultracentrifuge până la 30 mii vol. pe minut sau mai mult. Microscop cu luminiscență. Incubatoare la 37 o C, cu scopul de a conține embrioni de pui și instrumente pentru lucrul cu aceștia. Termostate cu parametri automati pentru incubarea embrionilor de pui infectati. Sticlărie și suporturi pentru eprubete, arzătoare etc.

Câteva reguli pentru lucrul în laboratoarele de virologie:

1. Doar angajații au voie să intre în laboratorul de virologie. Este obligatoriu schimbarea în îmbrăcăminte specială în concordanță cu munca pe care o desfășoară (robă, șapcă, pantofi).

2. Înainte de a intra, asigurați-vă că aveți un covoraș înmuiat într-o soluție dezinfectantă.

3. Toate tipurile de lucrări cu material contaminat sau suspectat contaminat trebuie efectuate strict în conformitate cu instrucțiunile.

4. Se impune lucrul în cutii cu atribute suplimentare în îmbrăcăminte: mască, halat dublu, mănuși, prosop, ochelari de protecție etc.

6. În cazul unui „accident” (pulverizarea materialului care conține virus), trebuie să sunați la manager sau un alt medic (fără a părăsi cutia apăsând butonul de sonerie) și să efectuați împreună dezinfecția conform instrucțiunilor.

7. Dacă este necesar, vaccinați-vă conform instrucțiunilor.

8. Materialul uzat care conține virusul este distrus prin autoclavare la 1,5 atm timp de 30 de minute.

9. După finalizarea lucrării, trebuie să vă schimbați într-un halat și pantofi obișnuiți, o șapcă sau batic în boxă, să vă spălați pe mâini cu săpun și, dacă este necesar, să le dezinfectați.

10. Înainte de muncă, cutiile sunt tratate cu vapori de formol și lumină ultravioletă. După muncă, tratați cu o soluție de 2% cloramină etc.

Reguli pentru munca studenților la Departamentul de Microbiologie și Virologie :

1. Atribuțiile ofițerilor de serviciu:

Împreună cu asistentul de laborator se verifică prezența și cantitatea instrumentarului (anse bacteriene, pensete etc.), materialelor destinate cursurilor (eprubete și pahare cu culturi, creioane pentru scris pe sticlă, hârtii cu violet de gențiană, coloranți etc. ), starea microscoapelor, obiectelor și ochelarilor de acoperire etc. Faceți înscrieri în jurnalul corespunzător pentru cei de serviciu. Primește material educațional de la asistentul de laborator și distribuie elevilor. Luați individual pahare și eprubete cu inoculare cu microorganisme.

La sfârșitul orelor, persoana de gardă verifică starea meselor de lucru, elimină toate defecțiunile la curățarea acestora, verifică disponibilitatea instrumentelor, microscoapei etc. Eprubetele și cupele cu culturi se predau individual asistentului de laborator, completează caietul persoanei de serviciu, predă camera asistentului de laborator și stinge luminile.

2. Responsabilitățile studenților :

Înainte de a începe lucrul. Puneți o halată medicală, fixați-o, puneți o șapcă sau o eșarfă. Puneți servietele și cărțile într-un sertar al biroului sau în pungi. Verificați starea mesei de lucru și a microscopului. Așezați un caiet, pix, creioane, inclusiv cele colorate, pe desktop.

În timpul lucrului. Manipulați cu grijă microscopul, sticlăria, instrumentele etc. Fiți atenți la toate etapele de lucru cu culturile bacteriene. Etichetați vasele cu germeni. Sterilizați bucla după ce ați terminat de lucrat cu culturi. În cazul unui accident (contaminare a suprafeței mesei, podelei, îmbrăcămintei, pielii etc. cu material infecțios), raportați incidentul profesorului și eliminați împreună contaminarea.

Dupa munca. Organizează-ți spațiul de lucru. Predați cupele și eprubetele inoculate persoanei de serviciu. Predați deșeurile ofițerului de serviciu. Toate instrumentele folosite trebuie arse pe focul unei lămpi cu alcool, sticla trebuie coborâtă în borcane cu soluție dezinfectantă. Faceți ordine microscopul și bancul de lucru. Spălați-vă bine mâinile cu săpun.

Intră și lucrează în sălile de antrenament fără halat sau șapcă. Mănâncă mâncare în incinta departamentului. Fumatul, aruncarea gunoiului. Așezați servietele, pălăriile și manualele pe masă și pe pervazurile ferestrei. Deteriorarea echipamentului. Mese murdare. Vorbește tare și râzi, fugi și interferează cu activitatea departamentului.

Pe vremuri, a fost o legendă la Facultatea de Biologie că într-un laborator de al 4-lea nivel de siguranță din URSS lipseau două „eprubete” cu o boală infecțioasă periculoasă. Au încercat să găsească persoana care a lucrat cu ei, dar acesta a plecat în vacanță. Panica a continuat să crească și a atins punctul culminant când directorul a primit un telefon de la Yalta și i s-a spus că avem corpul angajatului tău aici, te rog să veniți după el. Răspunsul regizorului a fost scurt și logic: „Nu venim la tine și nici tu, te rog, nu veni la noi”. Se spune că în mintea lui a estimat distanța până la Yalta. Ulterior s-a dovedit că angajatul se grăbea și a uitat să noteze că probele au fost eliminate și, din păcate, s-a înecat în Yalta. S-a oprit izbucnirea unei boli periculoase :) .

Dar este totuși interesant de văzut cum arată laboratoarele în care sunt depozitate și studiate cele mai periculoase boli. În practica internațională, există 4 niveluri de laboratoare pentru lucrul cu agenți patogeni biologici. Cu toții cunoaștem pictograma Risc biologic sau pericol biologic.

Voi începe în ordine. Cele mai simple și mai inofensive sunt laboratoarele de nivelul 1. Ele lucrează cu culturi celulare, viruși și bacterii, care sunt considerate neinfecțioase. Acestea nu trebuie separate de clădirea principală, iar lucrătorii folosesc echipament de protecție simplu: halat, mănuși și protecție parțială a feței.

Al doilea nivel de protecție este în general similar cu primul, dar ar trebui să existe deja acces limitat în timpul lucrului și toate manipulările sunt efectuate în încăperi laminare speciale. În astfel de laboratoare, ei studiază infecțiile care provoacă boli ușoare, precum și cele care cu siguranță nu sunt transmise prin picături în aer. De exemplu, acestea sunt unele hepatite, tulpini comune de gripă, salmonella.

La nivelul 3 devine mai interesant. Există deja restricții stricte de acces, intrarea în laborator are uși duble și vestibul, acest lucru vă permite să limitați schimbul de aer între camere. Când cineva lucrează într-un laborator, alții nu pot intra în el. Probabil ați văzut în filme că alți angajați bat de obicei la ușă pentru ca persoana dinăuntru să le deschidă. Asta nu înseamnă deloc că persoana din afară nu are acces, doar că în timpul cercetării, nimeni nu ar trebui să meargă acolo, așa că bat, încercând să se prefacă a fi pisica Shrek, pentru a avea voie să intre. Toate mișcările agenților patogeni sunt reglementate și trebuie efectuate numai în încăperi laminare speciale. Aerul este procesat și nu trebuie amestecat și să intre în ventilația clădirii principale. Angajații poartă mai multe haine (de regulă, fața, capul și brațele ar trebui acoperite cât mai mult posibil, iar rochiile nu au nasturi în față, ci doar cravate în spate). După muncă, hainele sunt prelucrate, dar totuși, acesta nu este încă un costum de protecție personală. În astfel de laboratoare se pot găsi deja boli mortale pentru care există vaccinuri sau medicamente eficiente. De exemplu, febra galbenă, virusul West Nile și agenții patogeni ai tuberculozei.

Nivelul 4 este conceput pentru a funcționa cu cei mai periculoși și contagiosi viruși și bacterii pentru care nu există tratament. OMS descrie designul lor ca fiind extrem de complex și, prin urmare, evită să ofere diagrame. În prezent, acestea conțin în principal o varietate de febre hemoragice, inclusiv virusul Ebola și Marburg. Aici apar deja costumele de protecție personală complet sigilate cu suprapresiune (deci oamenii să pară jucării de cauciuc umflate). Este necesară o presiune excesivă, astfel încât, în caz de deteriorare, aerul să iasă din costum și să împiedice intrarea aerului din laborator în costum. În laborator propriu-zis, dimpotrivă, se menține o presiune ușor redusă, astfel încât dacă camera se depresurizează, aerul să nu iasă din ea.

Există reguli suplimentare pentru lucru, de exemplu, în astfel de laboratoare este interzis să lucrezi singur, prezența unui partener este obligatorie. Începând de la nivelul laboratorului al treilea, fiecare angajat trebuie să poarte cu el o fișă specială de reamintire care indică numerele de telefon ale celor pe care trebuie să-i sune în caz de simptome suspecte, precum și instrucțiuni pentru medicul curant. Dacă decideți să comunicați cu cineva din afara laboratorului, va trebui să utilizați o conexiune specială pentru a face acest lucru - din păcate, nu veți putea striga.

Schimbarea hainelor este un ritual în laboratoarele de înaltă securitate. Ca și în laboratoarele de nivelul 3, toată îmbrăcămintea este îndepărtată complet și după un duș se îmbracă ceva de genul unui costum de personal medical. Unul dintre detaliile amuzante atunci când te schimbi în salopetă este lipirea graniței dintre șosete-pantaloni și mănuși-mâneci cu bandă adezivă, pantalonii sunt înfipți în șosete (te poți simți cu adevărat ca Batman). După bandă, costumul sigilat în sine este îmbrăcat și conectat la o sursă de aer. În filmele în care sunt prezentate astfel de laboratoare, se vede uneori că un furtun răsucit în spirală se întinde de la costum până la tavan, iar aerul intră de fapt în costum prin el. Cel mai dificil lucru în timpul lucrului este să nu te încurci în acest furtun, așa cum se întâmplă de obicei cu un aspirator conectat la rețea. Dar costul erorii este diferit.

Pentru a intra în acest laborator, trebuie să treci prin toate cele șapte cercuri ale iadului, niveluri de protecție: numeroase suflete, o cameră cu vid, iradiere cu ultraviolete și tot ceea ce poate face imaginația dezvoltatorului (aceasta este una dintre puținele profesii în care paranoia este încurajată). ). Se spune că acrobația este atunci când trebuie să te scufunzi sub perete prin piscină. Costumele moderne sunt destul de convenabile pentru manipulare, dar, în orice caz, trebuie să te antrenezi, deoarece chiar și o acțiune atât de simplă precum așezarea pe scaun poate provoca dificultăți - pentru că ai dificultăți să simți ce se întâmplă în jurul tău. Dar mai există un inconvenient important, înainte de a intra în laborator (și, după cum puteți vedea, procesul nu este atât de simplu), trebuie să vă gândiți cu atenție, deoarece în incinta nivelului 4 de protecție nu există toalete. deci va trebui să îndurați până la sfârșitul experimentului :) ( Probabil că este mai bine să vă abțineți și de la apă potabilă).

După muncă, trebuie să treci printr-un duș chimic cu costumul pentru a distruge toate probele (dușul va dura câteva minute, așa că dacă cineva încă nu a rezistat să bea apă înainte, atunci aceste minute pot părea o eternitate :) ). Apoi, un duș regulat și schimbarea în haine civile.

Ca exemplu de astfel de laborator, aș dori să citez infograficele ilustratorilor occidentali:

Interesant este și planul de acțiune pentru diverse situații de urgență. De exemplu, în cazul depresurizării, agenții încep să curgă în ventilație, ceea ce ar trebui să dezactiveze orice agenți patogeni. De regulă, aceștia sunt compuși destul de agresivi, cum ar fi peroxidul de hidrogen și formaldehida, astfel încât materialele din care este construită clădirea trebuie să fie rezistente la acestea (lemnul și tapetul colorat nu sunt potrivite aici, dar se pot găsi totuși soluții elegante).

Din motive evidente, jurnaliștii și simpatizanții nu au voie să intre în astfel de laboratoare, așa că este aproape imposibil să vezi laboratorul din interior. Totuși, la Boston, înainte de începerea funcționării noului laborator de nivel 4, au făcut un tur al acestuia și au spus ce măsuri de precauție au fost luate în el. Puteți vedea acest tur uimitor pe video, dar, din păcate, este în engleză.

Nu sunt atât de multe laboratoare de nivel 4. Din câte știu, sunt cincisprezece dintre ei în SUA, iar în Rusia există doar unul, acesta este „Vector” în Koltsovo (Novosibirsk). Unicitatea sa constă în faptul că doar două laboratoare din lume: Vector și Centers for Disease Control and Prevention din SUA depozitează tulpini de variolă. Problema distrugerii lor complete este pusă periodic, dar decizia finală nu a fost încă luată.

În ciuda fricii oamenilor de viruși și bacterii, care este cultivată cu atenție de televiziune, acestea nu sunt atât de groaznice pe cât cred oamenii. Temerile noastre nu se nasc din viruși, ci din ignoranță. Câți oameni au refuzat să comunice pur și simplu cu persoanele infectate cu HIV, deși este absolut sigur. Cel mai important lucru este să urmați recomandările și instrucțiunile. Toate infecțiile care apar în astfel de laboratoare nu sunt rezultatul unei erori de sistem sau computer, ci rezultatul neglijenței umane. Prin urmare, citiți cu atenție și ascultați instrucțiunile de siguranță și totul va fi bine cu voi :).

Oricine este interesat de subiect poate arunca o privire :)